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聚丙烯酰胺凝膠電泳的作用原理以及實(shí)驗(yàn)結(jié)論

來源:本站人氣:1254發(fā)表時(shí)間:2020-07-11

作用原理:聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和分子篩效應(yīng)。它有兩種形式:天然聚丙烯酰胺凝膠和變性聚丙烯酰胺凝膠。

在蛋白質(zhì)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中,蛋白質(zhì)可以保持完整,并根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、蛋白質(zhì)的形狀和附著在其上的電荷量在梯度上逐漸分離;在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中,脫氧核糖核酸以雙鏈狀態(tài)遷移,其流動(dòng)性受堿基組成和序列的影響。


聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn).jpg


在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中,蛋白質(zhì)變性劑——通常是SDS(SDS-PAGE),核酸變性劑通常是尿素、甲酰胺等。所以它的分離只取決于分子量。蛋白質(zhì)的SDS-PAGE技術(shù)是沙博理在1967年首次建立的。他們發(fā)現(xiàn),在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子洗滌劑和強(qiáng)還原劑(SDS是十二烷基硫酸鈉)后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基的分子量(電荷因子可以忽略不計(jì))。

Acr聚合只能在自由基存在的情況下發(fā)生,這需要催化誘導(dǎo)劑系統(tǒng)來產(chǎn)生自由基,如過硫酸銨-temed(四甲基乙二胺)和核黃素-temed。前者經(jīng)歷化學(xué)聚合,而后者經(jīng)歷光聚合。在化學(xué)聚合過程中,引發(fā)劑TEMED加速了過硫酸銨自由基的形成,使Acr單體轉(zhuǎn)化為自由基態(tài),導(dǎo)致聚合。溶液的酸堿度對(duì)聚合很重要,因?yàn)槿绻釅A度太低,沒有足夠的堿來加速催化反應(yīng),太多的氧分子會(huì)很快停止聚合。因此,當(dāng)制備凝膠時(shí),在加入過硫酸銨之前,必須除去混合物中的空氣。核黃素催化的聚合常用于制備濃縮凝膠,因?yàn)橛眠@種方法制備的凝膠孔徑較大。核黃素在光照射和微量氧存在下產(chǎn)生自由基聚合Acr。

聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖.jpg

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)域電泳。凝膠由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳利用電泳和分子篩的雙重作用來分離物質(zhì)。

當(dāng)Acr和Bis單獨(dú)存在或混合存在時(shí),它們是穩(wěn)定的,但是當(dāng)它們具有自由基體系時(shí),它們可以聚合。引發(fā)自由基團(tuán)有兩種方法:化學(xué)方法和光化學(xué)方法?;瘜W(xué)法的引發(fā)劑為過硫酸銨(Ap),催化劑為四甲基乙二胺(Temed)。光化學(xué)法用核黃素代替過硫酸銨作為光敏物質(zhì),在紫外線照射下引發(fā)自由基。使用不同濃度的Acr、Bis和a

TEMED將它們聚合成不同孔徑的凝膠。因此,可以根據(jù)分離物質(zhì)的大小和形狀選擇凝膠濃度。

聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為兩種類型:圓盤電泳和垂直平板電泳,但它們的原理完全相同。垂直板狀因其薄板、冷卻、高分辨率、操作簡單、便于比較和掃描等優(yōu)點(diǎn),被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。


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